凝胶固化酶研究与应用概况□刘勇 酶作为一种天然高活性、高选择性的催化剂，可以使许多难以进
酶作为一种天然高活性、高选择性的催化剂，可以使许多难以进行的有机化学反应在其催化下顺利进行，而且可避免或减少副反应的发生；它又是生物传感器的主要分子识别元件，具有优良的选择性和灵敏性。但是目前认为酶是一种蛋白质，稳定性差，对热、强酸、强碱、有机溶剂等均不够稳定，即使在最佳反应条件下，也往往会很快失活，且酶在反应后不能回收；而对于生物传感器来讲，固定化技术的发展是提高传感器灵敏度的关键之一。因此，酶的固定化技术一直受到化学生物学、生物医学工程以及生命科学等领域研究者的关注。 一、酶固化技术
一、酶固化技术 目前，酶的固定化技术主要有5类：物理吸附法、共价键法、离
目前，酶的固定化技术主要有5类：物理吸附法、共价键法、离子结合法、交联法以及包埋法。它们各有其优点与不足。吸附法方法简便，但制得的固定化酶容易发生泄露或脱落，选择性差。共价键法不易发生分子泄露，并且改变了分子在表面的定向、均匀的分布状况；但更容易破坏酶的活性中心，酶回收率低，并且操作工艺复杂，耗时，成本高。离子结合法的操作简单、条件温和，酶活性中心的氨基残基不易被破坏，但在离子强度高的溶液中反应时，酶往往从载体上脱落。交联法反应难以控制，酶容易因为活性位点被结合而失活，并且需要的酶量比较大，形成的固定化酶坚固性差，固定化酶在多分子的固定化层中活性比较低。包埋法包括微囊法和网格法，是将酶包埋于聚合物胶、膜或活性剂基底中，是较为直接、更为接近生物体的一种固定化技术，过去多是固定化于聚氯乙烯、聚乙酰胺、聚碳酸酯或半透明的Nafion膜内；但是酶在聚合物中容易丧失活性。 酶固定化后经常会改变性质，其原因主要有空间效应（固定化使
酶固定化后经常会改变性质，其原因主要有空间效应（固定化使酶构象的改变）、微囊效应（酶和底物微环境的改变）、分配效应（酶反应时底物在溶液和载体间的分配）、扩散效应等。 酶在固定化之后需要达到如下要求：仍能维持良好的生物活性和
酶在固定化之后需要达到如下要求：仍能维持良好的生物活性和反应专一性；能适应酶固定化前的各种环境，甚至是更为苛刻的环境；固定后要易于回收，有良好的稳定性和耐用性；减少酶组分的相互作用，保持其原有的选择性。 二、溶胶-凝胶技术
二、溶胶-凝胶技术 溶胶-凝胶（Sol-gel）技术是近10年内发展的采用包埋法固定
溶胶-凝胶（Sol-gel）技术是近10年内发展的采用包埋法固定酶的技术。该技术反应温和，为酶等生物分子包埋于无机质中提供了条件，由于制得的凝胶孔径在纳米级，故又称纳米凝胶。早在多年以前，人们就认识到利用Sol-gel可以将有机物分子包埋于无机基质中，且能使包埋物质的物理化学性质保持不变。但是对于生物分子而言，由于受传统观念的束缚，认为醇盐的高反应活性会改变生物分子的表面，凝胶的收缩也会对生物分子产生一定的压力，包埋的酶也产生一定的取向，可能影响其活性。直到1990年以色列科学家报道了利用Sol-gel将碱性磷酸酶（ALP）引入无机SiO2中，制得具有一定生物活性的材料，酶的Sol-gel固定化技术才得以广泛研究，近10年内研究进展非常迅速。 Sol-gel法是以金属有机或无机化合物为前驱体，通常为金属或
Sol-gel法是以金属有机或无机化合物为前驱体，通常为金属或半金属（Si、Al、Sn等）烷氧化物，如正硅酸甲酯（TMOS）和正硅酸乙酯（TEOS）等，经水解、缩聚反应由溶胶形成凝胶的过程。凝胶化Sol-gel过程大致可分为3个阶段：水解、缩合和聚合。实际体系中，这3步反应是交叉进行的。只要有醇盐水解产生出羟基，缩聚反应就会随即发生。酶分子就是在Sol-gel前驱体发生上述过程中被包埋于Si-O-Si形成的网络中的，然后经过老化干燥得到干凝胶。 三、反应条件对凝胶性质的影响
三、反应条件对凝胶性质的影响 凝胶制备过程中的前驱体类型的选择、水解度的选定以及催化剂
凝胶制备过程中的前驱体类型的选择、水解度的选定以及催化剂类型的确定，对溶胶凝胶过程中反应的进程、凝胶化时间和老化时间均产生很大影响，从而影响到溶胶凝胶的孔径、孔隙的分布、比表面积、质量分布和其他一些结构性质，进而影响到酶的高级结构，使酶的生物化学性质发生改变。 1.凝胶过程参数对凝胶性质的影响
1.凝胶过程参数对凝胶性质的影响 （1） 前驱体的影响
（1） 前驱体的影响 金属醇盐的水解缩聚活性和金属原子有关。一般而言，金属原子
金属醇盐的水解缩聚活性和金属原子有关。一般而言，金属原子的电负性越小，离子半径越大，配位不饱和度越大，金属醇盐水解的活性越强。随着金属原子半径的增大，电负性降低，金属醇盐更易于水解。 硅的水解和聚合反应通常不易发生，要加入酸碱催化剂来促使反
硅的水解和聚合反应通常不易发生，要加入酸碱催化剂来促使反应的发生。而过渡金属反应相对容易发生，凝胶化时间也很短，有的甚至需要在低温甚至加入其他溶剂进行金属络合来控制反应的速度。另外，烷氧基的空间结构也对凝胶化过程影响很大。 （2）催化剂的影响
（2）催化剂的影响 凝胶过程的催化剂主要为酸碱，也有以盐类为催化剂，其影响因
凝胶过程的催化剂主要为酸碱，也有以盐类为催化剂，其影响因素主要为酸碱（或盐）的类型及其用量，研究的主要方向集中在酸碱量的多少，即溶液的pH值对Sol-gel过程水解和聚合反应的影响上。在酸性环境中，制得的凝胶致密且比表面积较低。在碱性条件下，水解速率也大于缩合速率。而在中性pH值下，SiO2粒子的溶解程度加剧，同时还导致粒子的去质子化的表面电荷增加，从而使团聚和凝胶化过程延迟。因此在酶分子活性范围内较高或较低的pH值都会加快凝胶化速度。采用单一催化剂（酸或碱）制得的凝胶孔径在1.5nm左右。 四、Sol-gel过程对酶活性的影响
四、Sol-gel过程对酶活性的影响 在酸性环境中凝胶化时间缩短，减少了酶与溶胶粒子的作用时
在酸性环境中凝胶化时间缩短，减少了酶与溶胶粒子的作用时间，有利于酶保持良好的构象。在碱性条件下，随着pH值升高，水解速率会加快。而在中性pH值下，团聚和凝胶化过程延迟，酶的构象改变较前者大。在没有醇影响的条件下，缩短凝胶化时间有利于酶保持其构象和活性。 另外，研究表明，老化和干燥时间对保持酶构象也有影响，老化
另外，研究表明，老化和干燥时间对保持酶构象也有影响，老化时间延长，酶的构象较短时变化大。在凝胶老化过程中，由于网络的孔径还较大，大于酶的三维尺寸，凝胶网络中存在的溶胶粒子同样会和酶发生作用，使得酶构象发生改变，从而影响其活性。 溶胶凝胶过程可采用以下方法加以改进：
溶胶凝胶过程可采用以下方法加以改进： （1） 由于甲醇对生物分子的危害小，应尽量采用TMOS为前驱
（1） 由于甲醇对生物分子的危害小，应尽量采用TMOS为前驱体而不用TEOS。 （2）起始反应用旋涡混合或超声波震荡，而以前均加入醇作互
（2）起始反应用旋涡混合或超声波震荡，而以前均加入醇作互溶剂。 （3） 在溶胶中加入生物活性分子之前，先加入一定的缓冲溶液，
（3） 在溶胶中加入生物活性分子之前，先加入一定的缓冲溶液，维持体系的酸碱度，防止生物分子失活或自聚。 （4）在凝胶沉淀化阶段，经常用适当pH值的缓冲溶液洗涤凝胶，
（4）在凝胶沉淀化阶段，经常用适当pH值的缓冲溶液洗涤凝胶，去除过程中生成的醇等有害物质。 五、凝胶固定化酶的应用
五、凝胶固定化酶的应用 迄今为止，已有很多利用溶胶-凝胶将酶固定的实例，尤其在生
迄今为止，已有很多利用溶胶-凝胶将酶固定的实例，尤其在生物催化剂和生物传感器等方面。这些固定化相应提高了酶的稳定性，但也伴随着一些活性的丢失。 1. 生物催化剂
1. 生物催化剂 目前用于生物催化剂的酶的包埋有脂肪酶、脱羧酶、醇氧化酶、
目前用于生物催化剂的酶的包埋有脂肪酶、脱羧酶、醇氧化酶、单氨氧化酶、胰蛋白酶以及天冬酰胺酶等，包埋后证明不但酶活性保持较好，而且酶的手性选择性、区域选择性以及对应异构选择性都保持较好。 有研究者采用Sol-gel技术将脂肪酶包埋于凝胶体系中，催化酰
有研究者采用Sol-gel技术将脂肪酶包埋于凝胶体系中，催化酰胺化反应，得到的酶活性是溶液酶的330%，并且对反应底物的手性选择性为97%～99%，包埋酶的重复使用性也很好。在包埋过程中加入了铁的混合物，使凝胶体系有了磁性，通过磁性分离含酶凝胶更加容易。也有人制备了ORMOILS基质，脂肪酶在上述基质中用作非均相催化剂，酶的活性迅速增大，对于纯的MEMS所得基质脂肪酶在其中的活性为溶液酶的13倍。随碳原子数的增加，酶活性增加。另外，酶的稳定性提高。 2.生物传感器
2.生物传感器 生物传感器主要将酶反应过程中的化学、光和热信号转换成电信
生物传感器主要将酶反应过程中的化学、光和热信号转换成电信号，目前Sol-gel法固定化酶在这方面的应用比较多。包埋的生物传感器的形状和方法也比较多。 （1）掺杂方法
（1）掺杂方法 将碳粉和酶一起加入到Sol-gel中，得到刚性、多孔导电的生物
将碳粉和酶一起加入到Sol-gel中，得到刚性、多孔导电的生物材料，这种生物材料保持了生物分子的活性，并且再生容易。金属陶瓷生物电极也通过将金属分散于Sol-gel中然后加入酶制得。 （2）生物陶瓷膜
（2）生物陶瓷膜 可以通过浸渍-包埋（dip-coating）或者网格包埋（spin-
可以通过浸渍-包埋（dip-coating）或者网格包埋（spin-coating），得到单层或多层的膜状生物活性材料。 Sol-gel法经过十几年的发展，已经取得了很大的进展，然而在
Sol-gel法经过十几年的发展，已经取得了很大的进展，然而在这个新兴的领域，还有很多基础理论和应用尚待进一步研究。其发展趋势将会有以下几个方面：将有机/无机杂合物用于Sol-gel过程对酶进行包埋，可以改善材料的机械性能等；为提高生物材料的活性，除SiO2基质外，引入其他各种基质；各种多官能团的前驱体（如含NH2、SH基团）也会得到应用并发挥其独特作用；为提高生物材料的力学性质，生物活性分子也将引入各种杂化材料基质中；用于多步骤催化反应以及多功能生物传感器的酶体系包埋也将成为重要方向。