“十五”国家科技攻关计划生物工程技术项目系列报道 （16）
阿维链霉菌高产菌株选育及发酵工艺改进
中国农业大学 宋渊
阿维菌素(Avermectins)是由阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)产生的一类结构相似的十六元环大环内
酯齐墩果糖双糖衍生物。阿维菌素的天然发酵产物共有8个组分:A1a, A1b, A2a, A2b, B1a, B1b, B2a和B2b，它
们的区别主要在于C-5、C-22，C-23和C-26位所连接的基团不同。其中A1a、A2a、B1a、B2a为4个大量组分，含
量在80%以上，A1b、A2b、B1b、B2b为4个少量组分，含量在20%以下。这8个组分都有杀虫活性，其中以B1的
杀虫活性最强。
由于阿维菌素具有高效、低毒、广谱的杀虫特性，至“九五”末，阿维菌素的发酵单位已达到1600?滋g/mL(B1)，
完成了发酵和提取的全过程研究，并进行了工业化生产，生产成本2000～3000元/kg。但与国际水平相比，生产成
本仍然较高，限制了其在农业生产上的应用。
一、攻关目标及完成情况
“十五”提出的攻关目标是:在“九五”攻关的基础上继续提高阿维菌素发酵单位，构建选择性产生B组分的
基因工程菌，以提高有效组分B1的比例，进一步完善阿维菌素的工业化生产工艺，降低生产成本。主要研究内容:
(1)继续采用传统的物理、化学诱变手段，筛选性状稳定的高产阿维链霉菌。
(2)采用基因工程手段构建高产基因工程菌，具体内容是:为解决阿维链霉菌在发酵中菌丝球内部供氧不足的矛
盾，将透明颤菌血红蛋白基因(VHb)整合到阿维链霉菌的染色体上，期望它的表达可以促进阿维链霉菌的菌体生长，
减缓由于菌丝球内部供氧不足引起的菌体自溶，从而提高阿维菌素产量;构建阿维菌素生物合成基因簇正调控基因
(aveR)的多拷贝工程菌，期望通过增加该基因拷贝数来提高阿维菌素的产量;构建仅产阿维菌素B组分的基因工程
菌，采用基因缺失或基因取代的方法使控制阿维菌素B组分向A组分转化的aveD基因缺失，这样的突变菌株只产
生阿维菌素B组分，不仅可以提高有效组分的含量，还可以简化后提取工艺。
(3)完善新获高产菌株的发酵工艺。
(4)完成新获高产菌株的中试，并实现工业化生产。
考核指标是:阿维菌素B1组分摇瓶发酵单位达到3500?滋g/mL，完成高产菌株5t发酵罐的中试，阿维菌素B1
组分发酵单位在5t发酵罐上连续3～5批发酵单位达到4500?滋g/mL， 在“九五”的基础上进一步降低生产成本
30%以上。
二、高产菌株的选育及新工艺的建立
(1)在高产菌株选育方面 完成了将透明颤菌血红素基因(VHb)整合到阿维链霉菌染色体上的工作:利用VHb蛋
白的穿梭表达载体pHZl252，将载体中VHb结构基因转入阿维链霉菌中，并表达出了有生物活性的VHb蛋白，经摇
瓶发酵初步证实，VHb蛋白在氧限条件下可明显促进阿维链霉菌生长和阿维菌素的合成，发酵液的溶氧越差，VHb
的作用越明显;完成了正调控基因aveR多拷贝菌株的构建:通过PCR技术扩增3.1kb的aveR基因，并将其克隆到多
拷贝质粒pKCll39和链霉菌整合载体pSETl52上，以上2个载体分别转入低产的和高产的阿维链霉菌中，在低发酵
单位的菌株中明显促进阿维菌素的合成;完成了仅产阿维菌素B组分基因工程菌的构建:aveD在阿维链霉菌中负责
由B组分向A组分的转化，该基因的突变，将获得仅产B组分的菌株。利用aveD基因的缺失载体pCZ8对阿维链霉
菌的aveD基因进行缺失，获得了aveD的缺失突变株，该突变株仅产阿维菌素B组分，突变株中B1组分的产量可
提高10%～15%;采用亚硝基胍、吖啶橙、紫外线和氯化锂分别对出发菌株的孢子和原生质体进行诱变，通过抗代谢
物理性筛选方法对突变株进行筛选，使阿维菌素B1组分的摇瓶发酵单位达到5000?滋g/mL，5t发酵罐中试水平达
到4500?滋g/mL，与“九五”期间相比，阿维菌素B1的发酵单位提高了1倍多。
(2)发酵工艺的改进 “九五”期间，对阿维菌素的发酵条件和控制已进行了比较详细的研究，“十五”期间，
主要是针对新获高产突变株，着重进行碳源和氮源物质对阿维菌素生物合成影响的研究，调整了淀粉和不同氮源物
质的用量，并在大罐发酵中进行了补料研究，确定了补料工艺，后期补料可延缓菌体的自溶，提高发酵单位。
(3)提取工艺的改进 改进的重点在于降低溶剂的使用量，改进后溶剂的使用量比“九五”期间下降了30%。
三、国内外进展
阿维菌素是上世纪80年代末由美国默克公司首先开发成功，当时文献报道的发酵单位是500?滋g/mL。上世纪
90年代以后，有关阿维菌素的遗传学和阿维菌素衍生物的报道很多，但关于发酵单位的报道很少，据了解目前国
际上阿维菌素的发酵水平约为8000?滋g/mL。
我国阿维菌素的发酵研究进步很快，“七五”期间发酵水平只有500?滋g/mL(总发酵单位，下同)，“八五”期
间达到1000?滋g/mL，“九五”期间达到1600?滋g/mL(B1)。经过“十五”攻关，阿维菌素发酵水平又得到很大的
提高，虽然目前我国的发酵水平仍然低于国外，但我们的综合成本明显低于国外。据悉，国外阿维菌素的发酵生产
已经全部停止，转向中国购买，我国已成为阿维菌素的生产大国，我国阿维菌素的发酵水平已经接近国际先进水平。
四、应用前景及经济社会效益
阿维菌素是目前最有效的杀虫抗生素之一，作为一种生物农药，安全、高效、对环境友好，被农业部推荐为无
公害农药，每年的使用量数百吨，2004年在杀虫剂的使用量上排第二位，2005年上升为第一位。目前，全球农药
市场中生物农药及转基因技术销售额已占10%，而我国则不到5%，阿维菌素在国内的应用和市场拓展有着广阔空间。
经过近20年的研究，阿维菌素的发酵单位已经从约50?滋g/mL提高到4500?滋g/mL(B1组分)。阿维菌素生产成本
已经从最初2万元/kg以上降至目前的1000元/kg左右，使得阿维菌素的应用进一步扩大。
随着高毒农药的禁用，阿维菌素的使用量每年以10%以上的速度递增，预计5年后的使用量将增加1倍以上，
应用前景良好。