“十五”国家科技攻关计划生物工程技术项目系列报道 （18）
L-丝氨酸高产菌株选育及放大试验工艺研究
新疆农科院微生物应用研究所 崔春生
L-丝氨酸属非必需氨基酸，是一种生糖氨基酸，在生物体内可由D-甘油酸作前体生物合成。L-丝氨酸作为一
种生化试剂，可广泛应用于食品、饲料、医药、农业及化妆品等领域。目前由于技术条件的限制，L-丝氨酸市场供
不应求，国内市场价格一直居高不下，且大部分依赖进口。
L-丝氨酸的生产方法有微生物发酵法、化学合成法、蛋白质水解法、酶法合成等。其中微生物发酵法以成本低、
杂酸少、易提取等优点倍受关注。传统的微生物发酵法大都通过诱变方法获得L-丝氨酸产生菌株，但存在发酵周
期长、收率低等缺点。国外已采用诱变筛选与基因工程技术相结合的方法获得氨基酸高产菌株，并用于工业生产。
一、项目完成情况
本项目在诱变筛选获得的L-丝氨酸生产菌株Brevibacterium flavum C-11基础上，同时克隆和超量表达与L-
丝氨酸生物合成相关的多个关键酶基因，构建高效的L-丝氨酸基因工程菌株，最终获得L-丝氨酸发酵产率高于
32g/L的菌株。通过该菌株的代谢调控研究，进一步降低杂酸产率。采用流加发酵工艺，250L发酵罐试验L-丝氨
酸产酸率≥32g/L，杂酸≤15%，发酵周期≤72h。采用离子交换法等提取纯化工艺，从发酵液中分离纯化L-丝氨酸，
提取率≥60%。已按计划完成相关指标，并于2005年11月顺利通过中国生物技术发展中心组织的项目验收。
二、新工艺特点
在原有L-丝氨酸产生菌株Brevibacterium flavum C-1的基础上，采用亚硝基胍诱变后，同时进行多种突变
型筛选：
（1）先用含选择类似物(D,L-噻吩丙氨酸等)的培养基筛选抗丝氨酸反馈抑制的突变株。5～10d内能在该培养
基上快速形成菌落的是抗丝氨酸反馈抑制的突变株。
（2）抗丝氨酸反馈抑制的突变株，采用极限培养基和极限选择培养基，筛选丝氨酸分解能力缺陷突变株。不
能在极限培养基上生长而可以在极限选择培养基上生长的为丝氨酸分解能力缺陷突变株。
（3）将获得的突变株进行摇瓶发酵，测定丝氨酸产酸率，并从中筛选丝氨酸产酸率较高的突变株。通过测定
丝氨酸以及各种杂酸的含量，发现大多数菌株的丝氨酸产率在16～17g/L左右，杂酸约20%，其中丙氨酸含量6g/L。
由于摇瓶发酵测丝氨酸产酸率的过程中丙氨酸产量较高，并且丙氨酸很难与丝氨酸分离。因此将获得的菌株继
续用亚硝基胍诱变后，筛选丙氨酸缺陷型菌株。由于丙氨酸的生成途径比较多，一次性获得丙氨酸缺陷型很困难，
可采用多步筛选的方法。首先进行了阻断丙酮酸在丙酮酸-L-氨基酸转氨酶催化下生成丙氨酸的途径研究，即筛选
氟基丙酮酸敏感型突变株。通过降低氟基丙酮酸的含量，获得丙氨酸产率有明显降低而丝氨酸产率有所提高的菌株，
将其命名为Brevibacterium flavum C-11。该菌细胞呈短杆状，不形成孢子，不运动，革兰氏染色阳性，具有稳
定的链霉素抗性。菌种的最佳生长温度为29～31℃，最佳pH值为7.0～7.8。摇瓶发酵72～80h，丝氨酸产率18～
20g/L，杂酸≤18%，其中丙氨酸含量3.7g/L。
克隆与L-丝氨酸生物合成相关的多个关键酶基因，包括磷酸甘油酸脱氢酶（phosphoglycerate dehydrogenase）
基因、磷酸丝氨酸转氨酶(phosphoserine transaminase)基因、磷酸丝氨酸磷酸酶(phosphoserine phosphatase)
基因和谷氨酸脱氢酶基因（glutamate dehydrogenase），同时连接在2个可在丝氨酸生产菌株中稳定复制和表达的
载体上，并转化已有的诱变筛选获得的L-丝氨酸生产菌株Brevibacterium flavum C-11，通过这些与L-丝氨酸生
物合成过程有关的多个关键酶基因的同时超量表达，获得L-丝氨酸产率得到较大提高的L-丝氨酸高产基因工程菌
株Brevibacterium flavum C-14。
对L-丝氨酸高产基因工程菌株Brevibacterium flavum C-14进行摇瓶、10L和250L发酵罐中试发酵工艺研究。
确定了菌种的保存、传代和活化方法，种子培养基组分、种子生长曲线测定、最佳接种种龄及接种量。还确定了基
因工程菌株Brevibacterium flavum C-14在250L发酵罐各项发酵参数，包括最适碳源、氮源、碳氮比、微量元素
含量以及发酵温度、pH值、通气量、转速及发酵周期等。进行了生长曲线、糖代谢、氮代谢和丝氨酸产率等曲线
的测定，确定了补料时间和补料量。基因工程菌株Brevibacterium flavum C-14在250L发酵罐培养72～76h，丝
氨酸产率29～33g/L。杂酸（主要为谷氨酸、丙氨酸及赖氨酸）14%～16%。
采用离子交换法进行丝氨酸的提取和纯化。首先将丝氨酸发酵液进行预处理，以除去菌体。并对阳离子交换树
脂进行酸化预处理。将除去菌体的丝氨酸发酵液上柱进行吸附，水洗除去杂质。用氨水洗脱丝氨酸，收集后真空浓
缩除氨。浓缩液调pH值后，进行活性炭脱色，真空浓缩，喷雾干燥，获得丝氨酸结晶。将获得的丝氨酸结晶溶解
后进行重结晶。最终获得的丝氨酸结晶中丝氨酸含量≥99.5%，丝氨酸提取率55%～60%。
三、推广应用前景及发展方向
国内虽然有采用微生物发酵法生产L-丝氨酸的厂家，但大多采用诱变筛选获得的菌株进行生产，由于诱变的
工作量大，盲目性高，而且筛选的突变株生理状态不佳或完全失调，产量的进一步提高受到限制，发酵产率最高只
能达到20g/L左右。由于工艺技术落后，难以参与国际竞争。该技术可明显降低L-丝氨酸生产成本，增强我国L-
丝氨酸产品竞争力，改变我国L-丝氨酸产业产酸率低，工艺落后，产品成本高，大量依赖进口的现状。
目前国内和国际市场的L-丝氨酸需求量很大，而L-丝氨酸产量低，售价较高。本课题在微生物发酵生产L-丝
氨酸的代谢调控，以及L-丝氨酸的分离、提取和纯化方面尚可开展进一步的研究工作，进一步丰富和提高技术水
平。
（本项目由新疆农科院微生物应用研究所、新疆特殊环境微生物工程技术中心及中国新疆-亚美尼亚生物工程研发
中心共同完成）