生物技术生产丙酮酸盐的应用和研究进展
青岛科技大学  高静 刘文娜 彭文岚
　　丙酮酸盐是一类重要的有机化工中间体，广泛用于杀菌剂、除草剂、食品添加剂等的合成，还用于生产镇静剂、
抗病毒剂以及合成治疗高血压病的药物，并在人体减肥药物方面显示了突出的功效。目前丙酮酸盐主要是通过化学
法和发酵法进行工业生产。其中，化学法是通过对酒石酸脱水和脱羧制得，该过程易实现，但由于酒石酸的高能热
分解现象使得生产成本较高，一些药厂尝试通过将乳酸盐氧化脱氢来生产丙酮酸盐。上述化学法生产过程能耗高，
且需要重金属，在环保方面备受争议。生物法生产丙酮酸盐可以用廉价的碳源直接进行发酵，采用可溶的酶或固定
化酶，利用生物技术生产丙酮酸盐逐渐成为研发热点。
    一、发酵法
　　发酵法生产丙酮酸盐的研究主要集中在多种维生素缺陷型的酵母平滑球拟酵母菌和类脂酸缺陷型结肠埃希氏杆
菌两种微生物上，平滑球拟酵母菌发酵生产丙酮酸盐已应用于工业中。
　　除筛选生产丙酮酸盐的菌株以及确定最佳的制备条件外，代谢工程及发酵工艺过程的优化也成为发酵法生产丙
酮酸盐的研究重点。研究者试验了不同的方法，例如对丙酮酸盐脱氢酶的旁路处理，应用两期的氧供应控制进路，
从而增加多种维生素缺陷型酵母菌生产丙酮酸盐的产量。通过使用70.0g/L的氯化钠溶液进行筛选，获得了一株对
氯化钠耐受的突变体即多种维生素缺陷型酵母-平滑球拟酵母菌RS23，利用这株突变体生产的丙酮酸盐浓度在82小
时内高达94.3g/L，丙酮酸盐的浓度和产量分别比亲株高41.1%和11.1%。
　　尽管一些研究者试图寻找新的具有高产丙酮酸盐能力的微生物，但仍然很难通过常规的突变体获得能够积累大
量丙酮酸盐的菌株。通过DNA重组技术构建突变体是获得高产丙酮酸盐菌株的又一条途径。
    发酵法是目前生产丙酮酸盐的一条重要途径，但通过发酵糖类来生产丙酮酸盐的产率却很低。在当前已知的生
产工艺中，利用酿酒酵母丙酮酸脱羧酶（PDC）的直接进化菌株发酵生产得到的丙酮酸盐的浓度最高，为135.0g/L。
从这种成分复杂的发酵液中回收丙酮酸盐一般较困难且费用较高。
　　二、生物催化法
    生物催化法制备丙酮酸盐可以通过采用完整细胞催化或酶催化来实现。在完整细胞催化中，丙酮酸盐是通过生
物催化法从生长底物中得到的，除一些特定的基质外，葡萄糖、甘油、柑橘皮提取液、1,2-丙二醇、延胡索酸均可
用于生产当中。另一方面，一些已经应用于发酵法的菌株也可以用于全细胞生物催化当中。例如，将E.coliYYC202
悬浮于缓冲液中，每克葡萄糖生产丙酮酸盐的最大产量可以达到0.93g。而用发酵法并不能得到这么高的产量，因
为大部分的葡萄糖都被消耗到了菌体的繁殖上。
    酶法合成化学品已经成为生产化学品的一条重要途径。不同的酶如甲醛脱氢酶、丙酮酸盐合成酶、乙醇酸盐氧
化酶、酒石酸盐脱水酶及D-氨基酸氧化酶都已经应用于酶法合成丙酮酸盐当中。Buto等人已将D-氨基酸氧化酶用
于丙酮酸的生产中；也用红酵母属D-氨基酸氧化酶进行生产并设计了用DL或D-氨基酸生产α-酮酸的反应器，在最
适合的操作状态下，90﹪以上的底物可以转化为丙酮酸盐。
    2001年，Miyazaki等人发现了新的酶法合成丙酮酸的方法，即利用PDC从乙醛和二氧化碳中合成，在对反应中
用到的碳酸氢盐缓冲液的pH值和浓度做出调整后，500mmol/L的NaHCO3-Na2CO3缓冲液中最大产率为81%。尽管丙
酮酸盐的浓度不是很高，但这个反应可能会逐渐成为一种可取的生产途径，因为其在生产的同时能够固定温室气体
二氧化碳，有利于保护环境。乙醇酸盐氧化酶（GO）和乳酸氧化酶能够催化L-乳酸盐生产丙酮酸盐和过氧化氢的反
应，具体反应如（1）所示：
         CH3-CH(OH)-COOH+O2→
         CH3-CO-COOH+H2O2           (1)
　　  Payne等人通过GO基因序列，并利用基因操作将多种序列表达经在甲基营养菌毕赤酵母属Pastoris的发酵
物中获得了高表达的spinachGO，其重组体P.Pastoris能够应用于全细胞生物催化生产丙酮酸盐的工业当中。然而，
副产物过氧化氢可将丙酮酸盐分解为醋酸盐、二氧化碳和水，从而降低了产率。为了解决这个问题，一般选用可产
生 GO和过氧化氢酶的汉森酵母属 Polymorpha及
P.Pastoris作为将L-乳酸氧化为丙酮酸的催化剂。乙醇酸盐氧化酶与催化酶的结合应用使其得到了很高的生物转化
率。
    有人已经发现了乳酸盐氧化酶（LOX）复合体生产菌株，将其命名为Edwardsiella和Pseadomonas，所获得的
LOX复合体能够有效地氧化D,L-乳酸盐，将消旋的乳酸盐加入到丙酮酸盐中可抑制过氧化氢的产生。LOX催化反应
过程如（2）所示：
        CH3-CH(OH)-COOH+0.5O2→
        CH3-CO-COOH+H2O            （2）
    尽管上述反应比起产生过氧化氢的反应具有更大的优势，但是需要有天然酶提取液才能实现。为了找到利用乳
酸盐生产丙酮酸盐的新方法，研究者从土壤中分离出了多种能利用乳酸盐的微生物，并已将菌株Acinetobacter作
为丙酮酸盐的生产菌株。在最佳反应条件下，浓度在200～500mmol/L之间的L-乳酸盐能够在8～12小时内几乎完
全转化成丙酮酸盐。在将上述方法工业化之前，在5L的反应器中反应42小时后，产物浓度达到了可商业化生产的
浓度，转化率为0.72g/g。尽管生物转化率会随反应时间的延长而降低，但这种生产方法能得到比微生物发酵更高
的转化率，因此依然具有应用前景。
    假单胞菌属Pseudomonas stutzeriSDM将乳酸盐转化为丙酮酸盐的能力很强。其细胞在低盐且含有D,L-乳酸盐
的培养基中培养，能以高转化率产生丙酮酸盐。在24小时内可以从25.5g/L的D,L-乳酸中得到22.6g/L的丙酮酸。
将蛋白组学分析法结合二维凝胶电泳以及光谱测定法确定了两种立体特异性的iLDHS（NAD-独立乳酸盐脱氢酶，能
以四羟酮醇依赖法催化乳酸盐转化为丙酮酸盐的过程）的存在，这在生产丙酮酸盐的菌株中是必不可少的。
    为了更好地了解Pseudomonas stutzeriSDM生产丙酮酸盐的作用机制，人们研究了菌株中iLDHS的生化组成。
结果显示，iLDHS可以使细菌通过电子交换链将乳酸盐作为碳源使用。这种乳酸盐氧化机制抑制了过氧化氢的生成，
从而提高了丙酮酸盐的产率，可见iLDHS能够用于生产当中并且具有巨大的商业潜力。
　  三、丙酮酸盐的回收
　　产物的回收是生产过程之外又一需要考虑的问题，有研究者用有机溶剂从发酵液中萃取出丙酮酸盐，又将其通
过蒸馏从溶剂中纯化出来，然而，萃取溶剂的使用并不被看好，因为这种方法耗能高但回收率低。在反萃取过程中
也研究了氢氧化钠及三甲胺的作用，在最适宜反应条件下，丙酮酸的回收率约在71%～82%之间，而乳酸反应了
89%~92%，经过单蒸馏处理后丙酮酸的纯度达到了97%。尽管回收率较高，但萃取剂TOA成本太高，不能进行商业化
生产。因此，寻找更新且更有效率的丙酮酸盐分离方法是当前至关重要的任务。
　　四、市场前景
　　尽管发酵法在当前的丙酮酸盐生产中占主要地位，但生物催化法一定会成为更受欢迎的方法，因其反应物的价
格低廉，底物的转化率更高。研究者尝试寻找环境友好型的生物催化过程，希望能够找到不同的底物将其转化为丙
酮酸盐。然而与发酵法相比，生物催化法的应用具有一定的局限性，一部分是由于生物催化法本身的局限性，例如
底物范围的限制、操作稳定性以及酶的利用率等问题。在一些酶发现方法的指导下，收集基因信息及应用直接诱变
的方法应该会为更多生物催化法的选择和实现提供基础。这些生产方法比从前报道过的方法更具有环保性和可持续
性。
　　生物催化过程中的反应物成分很普通，为丙酮酸盐生产与其他合成过程的偶联提供了可行性。廉价的底物如乳
酸盐可以在合成过程中作为丙酮酸盐的替代品使用，这种由生物催化剂催化的丙酮酸盐生产体系能够应用于其他相
似的反应，从而可以应用乳酸作为起始材料合成诸如L-3,4-左旋多巴等的化合物。