十一 · 五“863工业生物技术”  专题系列报道（4）
颗粒状甲烷单加氧酶的高效表达及其智能控制
清华大学   邢新会
　　颗粒状甲烷单加氧酶（pMMO）存在于甲烷氧化菌的细胞膜上，为氧化还原酶，其体外稳定性差，分离纯化步骤
烦杂、难度大，而且其催化反应需要辅酶NADH的参与，从传质和生物反应角度，使用含高活性pMMO的整细胞更有
利于甲烷生物转化反应的实现。本课题组项目系统选择不同加氧功能基因的启动子构建pMMO表达载体，使用具有膜
结合单加氧酶功能的不同宿主，建立高效表达pMMO的基因工程技术，并利用荧光蛋白GFP建立pMMO的智能控制方
法基础；研究重组pMMO催化的特性及其影响因素，获得其生物转化的小试工艺参数。
　　一、项目目标及完成情况
项目目标
完成情况
1. 建立一株以上表达
pMMO基因工程的菌
株，其pMMO的活性
高于已有的pMMO重
组红球菌的酶活。
?    系统构建了pMMO的系列表达体系，首次成功克隆
了含pmoCAB基因及其原始启动子Pσ70的完整基因
片段，发现了影响表达pMMO活性的关键问题，获
得了三种基因工程菌，其中一株的pMMO活性与
pMMO重组红球菌的酶活有明显的变化。
?    解析了我国煤矿甲烷氧化菌种群，得到了有用的菌
群信息。
2. 确立在5升发酵罐
细胞浓度达到干重
10g/L以上的pMMO
重组细胞培养方法及
其催化甲烷的反应体
系，阐明重组pMMO
的催化特性及影响因
素，使利用甲烷的催化
反应稳定在24h以上。
?    利用甲烷传递体确立了在5L发酵罐培养包括
pMMO重组细胞的甲烷氧化菌的快速高密度培养方
法及其催化反应体系，菌体浓度可达干重14g/L发
酵液以上的水平；
?    甲烷催化生成甲醇的反应稳定在24h以上，甲醇浓
度超过30mM，远远超过文献报道值；建立了整细
胞直接催化丙烯生产环氧丙烷的方法，环氧丙烷积
累浓度可达12.2mM，是目前文献报道的最高值。
二、关键技术及主要成果
    1. 颗粒性甲烷单加氧酶基因重组表达载体的构建及异源重组菌的催化性质研究
    本课题组通过对异源表达载体、启动子和宿主菌三方面的系统考察，建立了pMMO异源表达体系，对
于加快MMO用于生物催化有重要的意义：首先从Methylosinus trichosporium OB3b得到pMMO基因
（pmoCAB），利用红球菌中含有脱硫基因启动子的穿梭质粒pBS305，构建了pmoCAB的新型表达质粒并导入
红球菌。荧光原位杂交实验验证了重组菌中pmoCAB基因被成功地转录，摇瓶培养实验表明重组菌具有pMMO
活性，表明成功构建了pMMO基因的异源表达体系。
    为了获得活力更高的重组菌，利用高拷贝穿梭质粒pCom10，构建了pCom10pmo重组质粒并转入产气肠
杆菌和假单胞菌中。荧光原位杂交验证了重组菌具有pMMO功能基因。气相色谱分析结果表明甲烷可以被
pMMO催化氧化为甲醇，同时还有趣的发现有乙醇的生成，并且重组菌pMMO活性高于重组红球菌。
    2. 甲烷氧化菌同源表达及突变体系的构建
    文献报道和项目前期研究结果表明，质粒形式很难使目的基因稳定存在于甲烷氧化菌中，为此项目组
尝试用同源重组的方法，使目的基因整合到甲烷氧化菌的染色体上，进而实现其在甲烷氧化菌中的稳定表
达。由于甲烷氧化菌的特殊性质，其接合转移手段很难实现，本项目组通过不断摸索，构建了有效的接合
转移操作平台，并运用该方法导入了自杀载体pTJS175，得到了和甲烷氧化菌OB3b发生同源交换的突变株，
这些突变株具有大观霉素抗性，且生长特性和原始菌相比没有明显差异。通过建立的甲烷氧化菌基因操作
平台，本课题组成功构建了以pk18mobsacB基因为主体框架的GFP重组载体。
    3. 基于荧光蛋白的智能生物催化体系的定量表征方法的研究
    为实现用绿色荧光蛋白GFP快速定量追踪特定荧光甲烷氧化菌的细胞浓度及酶催化特性，课题组以大
肠杆菌为模式体系，研究了细胞散射和光吸收对荧光检测的影响以及表达绿色荧光蛋白的细菌荧光与细胞
浓度的关系，建立了校正荧光内滤器效应的数学模型，为GFP标识的整细胞MMO催化快速定量解析提供了
方法基础。
    4. 利用甲烷传递体快速、高密度培养甲烷氧化菌及其催化方法研究
    通过对各种有机溶剂进行筛选的结果发现，石蜡油可以有效促进甲烷传递及M. trichosporium OB3b
快速生长并大大提高细胞的密度。在含有石蜡油的培养基中，甲烷的溶解度提高了，但溶氧并没有降低。
5L发酵罐实验结果表明，培养基中添加5%的石蜡油，菌体增长速度和浓度显著增加，培养24h后细胞浓
度可达干重14g/L，是对照实验的5倍多。另外，石蜡油对甲烷氧化菌细胞形态和代谢产物也有明显影响：
5%石蜡油使细胞主要代谢物甲酸、丙酮酸的浓度明显增高。SDS-PAGE结果表明，添加石蜡油不会影响菌体
的蛋白表达水平。这一快速高密度培养方法为甲烷氧化菌及含MMO细菌的培养及生物催化提供了基础。
    5. 利用分子生态学技术寻找新的甲烷氧化菌功能基因
    由于甲烷单加氧酶蛋白结构异常复杂，且已知的甲烷氧化菌的种类和甲烷单加氧酶基因都十分有限，
因而寻找新的甲烷氧化菌和甲烷单加氧酶基因具有十分重要的意义。本项目组以我国河南某典型高瓦斯煤
矿为对象，以甲烷氧化菌的功能基因pmoA、mmoX和mxaF为考查目标，建立了煤矿瓦斯降解的基因文库，
通过对基因文库进行RFLP和生物芯片分析，初步得到了该煤矿碱性土壤中甲烷氧化菌和甲基氧化菌的种
类及分布情况。除了发现与该碱性土壤相适应的I型碱性甲烷氧化菌Methylobacter/Methylomicrobium
外，还发现了大量的II型甲烷氧化菌Methylosinus 和 Methylocystis和部分I型嗜热甲烷氧化菌
Methylococcus/Methylocaldum；而甲醇脱氢酶功能基因mxaF的分析表明Methylopila和 Hyphomicrobium
等甲基氧化菌与甲烷氧化菌共同存在于该环境中。
    6. 甲烷氧化菌M. trichosporium OB3b的等离子体诱变筛选
    以提高甲烷氧化菌的生长速度和催化活性为目的，本课题组建立了常压低温等离子体诱变方法和筛选
方法，得到两株诱变菌株。诱变后的甲烷氧化菌细胞内自由水的含量增多，形态也相应发生了变化，更加
饱满。诱变菌株μmax提高更显著，比无Cu2+培养基中增加约1.93倍。另外，诱变菌株sMMO活性显著增
加，而甲醇脱氢酶MDH的活性略有下降，但是合成甲醇能力均有所增加。传代实验结果表明诱变菌株在各
性能方面有遗传稳定性。因此诱变出的甲烷氧化菌在工业应用方面具有极大的潜力。
三、技术推广及应用
　　本课题组通过对颗粒状甲烷单加氧酶的高效表达及其智能控制的研究，极大地推进了甲烷单加氧酶的
应用进展，积累了基础性数据，在能源、环境治理、温室气体减排等重要领域具有非常重要的意义和应用
前景。目前项目组正在和煤炭企业进行合作，将甲烷氧化菌用于治理煤矿瓦斯气体。
　　甲烷氧化菌内甲烷单加氧酶在常温常压条件下能够将甲烷直接氧化为甲醇，对实现甲烷清洁转化具有
重要意义，pMMO还具有催化五碳以内的烷烃及烯烃的能力，也是生产大宗化学品的重要生物催化剂。
　　甲烷是一种清洁的能源，又是重要的基础化工原料，是未来石油的重要替代资源之一，本课题组的研
究将为基于可再生生物质资源的可持续工业生物技术的发展提供新的方法和途径，具有重要的战略意义和
实际应用价值。