十一 · 五“863工业生物技术”  专题系列报道（6）
丁醇生物制造的关键技术
中国科学院微生物研究所  张延平 李寅
　　丁醇是一种重要的化工原料，可用于制造溶剂、增塑剂、萃取剂等。近年来由于其优异的燃烧和运输性能，丁
醇又被认为是一种极具潜力的新型生物燃料，获得国内外的普遍重视。发酵法生产丙酮丁醇曾经是仅次于乙醇的全
球第二大发酵工业，随着石油价格的不断上涨和能源、资源问题的日益凸现，丁醇发酵工业已迎来复苏产业的大好
时机。中国科学院微生物研究所在“十一五”863项目的资助下，开展了“丁醇生物制造的关键技术”研究，取得
了一系列重要的研究成果。
一、    项目目标及完成情况
项目目标
完成情况
1. 获得与碳水化合物代谢、丁醇生
物合成、溶剂胁迫应答相关的重要基
因和蛋白的相关信息，分离、克隆
3~4个对丁醇生物合成有重要调控
作用、以及与溶剂胁迫相关的酶及其
编码基因
通过基因组重测和比较基因组学分析，得到突变株相对于野生型共
94个较高准确度的SNP位点，发生SNP突变的编码基因大多与胞壁
合成、非中心碳代谢、膜转运系统以及转录因子有关；通过比较蛋
白质组分析，发现了与溶剂耐受、丁醇生物合成相关的重要分子基
础，克隆了至少20个与丁醇合成或胁迫相关的基因，并研究了其生
理功能。
2. 获得主要生产丁醇和氢气、不产
或低产丙酮或乙醇的丁醇生产菌，分
批发酵中丁醇对葡萄糖转化率达到
40%以上，丁醇发酵时间缩短30%
建立了C.acetobutylicum新型遗传操作系统。根据组学分析的结
果，构建了数株性能优化的基因工程菌。其中丙酮途径缺失的突变
株，丙酮产量大幅下降，将总溶剂中丁醇比例提高到85%~90%，分
批发酵中丁醇对葡萄糖转化率达到40%。
3. 通过基因工程技术和代谢工程技
术，获得能够耐受高浓度丁醇的工程
菌株，分批发酵产量超过40 g/L
建立了适用于丙酮丁醇梭菌的随机突变技术及高通量筛选高产突变
株的方法，获得了能够耐受较高浓度丁醇(≥19 g/L)且溶剂合成能
力大幅度提高的突变株；采用发酵-萃取-气提技术，分批发酵总溶
剂浓度超过40 g/L，并完成了中试。
4. 建立丁醇发酵与分离耦合反应示
范装置，溶剂总浓度≥150 g/L
建立了丁醇发酵-渗透汽化分离耦合反应体系，总溶剂浓度达到184
g/L。

二、    关键技术及主要成果
    1. 高产突变株的高通量筛选技术
　　发酵丁醇或溶剂的快速测定是进行突变菌株高通量筛选的基础。为此，我们利用代谢产物与次碘酸钠等化合物
的特征反应，建立了基于酶标仪、96孔板以及96孔深孔板的高通量筛选高产突变株的方法，筛选突变株的数量从
50~100株/次扩大到500~1000株/次，并且在3~5 h内就可知道每株突变菌株的溶剂产量和生长情况。目前，该方
法已申请中国专利（专利号200810240859.4）。
    2. 梭菌遗传操作技术
　　梭菌的遗传可操作性是认识、控制和利用梭菌的基础性工作。到目前为止，科学家对梭菌的遗传操作能力只限
于少数几个种类的模式菌，一个重要原因就是梭菌中存在着非常严格的限制修饰系统，外源DNA进入梭菌后很快就
会被降解。为了使梭菌的遗传操作变得更加容易，我们以丙酮丁醇梭菌为研究对象，在基因组上找出编码其限制修
饰系统的可能基因并使其失活，获得的工程菌株能够高效接受未经修饰的外源DNA，并用实例证明在该工程菌株中
可以快速、方便地进行基因表达和基因失活等研究工作。
    3. 兆质粒上基因敲除技术
　　提高丁醇的转化率对增强丁醇生产的经济竞争力非常重要。代谢途径分析表明，丙酮、丁醇和乙醇的代谢途径
并不相互依赖；在某些营养和环境条件下（如以甘油为底物时），产溶剂梭菌几乎不产丙酮，而只产生丁醇。这两点
从理论上证明丙酮途径可以被阻断，但是编码丙酮途径的基因簇位于兆质粒上，对质粒上的基因进行遗传修饰较为
困难。课题组开发的内含子插入失活系统对梭菌目标基因突变效率可以达到60%以上，利用该系统成功敲除了位于
兆质粒上的丙酮合成途径关键酶乙酰乙酸脱羧酶基因adc，C.acetobutylicum产丙酮比例降低约80%，而产丁醇比
例提高了15%~20%，从而为兆质粒的遗传操作提供了经验和技术支持。
    4. 丙酮丁醇梭菌蛋白质组参考图谱和比较蛋白质组分析技术
　　利用二维电泳（2-DE）和基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF-TOF）技术，我们首次建立了高分
辨率的丙酮丁醇梭菌胞浆蛋白的双向电泳参考图谱。共鉴定了1206个蛋白点，对应564个不同的蛋白质，约占整个
丙酮丁醇梭菌蛋白质组的20%，蛋白质的鉴定成功率达到93.5%。所有主要代谢途径中都有50%左右的蛋白得到了鉴
定，表明该参考图谱在基因组规模上有很好的覆盖度。双向电泳参考图谱为深入研究丙酮丁醇梭菌产溶剂的生理学
奠定了重要基础。
    5. 丁醇耐受性改造技术
　　丁醇耐受性是一个涉及到多因素的生理特性，是影响溶剂产量的一个关键限制因素。一般情况下，当丁醇浓度
达到13 g/L时，发酵就基本停止。本课题组开发了针对丁醇耐受性的菌种改造技术，将丙酮丁醇梭菌的丁醇耐受性
提高至19 g/L，丁醇产量同步提高，达到国际同类高产菌株的生产水平；进一步通过对高丁醇耐受突变株及其野生
型进行基因组和蛋白质组学水平的比较分析和转录水平的验证，发现了多个丁醇耐受相关的靶基因或蛋白，为利用
系统生物技术对菌株丁醇耐受性进行改造奠定了基础。
    6. 丁醇发酵-渗透汽化分离耦合技术
　　渗透汽化主要是利用膜的选择性从发酵液中移除挥发性组分。发酵液中的挥发性组分或有机组分有选择性地在
膜内汽化透过，而营养物质、糖以及微生物细胞等被截留下来，分离组分通过浓缩回收。相比于传统分离手段如气
提、液液萃取、吸附等，渗透汽化具有选择性好、易操作、能耗低等优点，且对反应体系基本没有干扰，但其主要
不足在于可选择的膜种类相对较少。本课题组开发制备的HTPB-PU膜或PDMS/PVDF复合膜，具有更高的分离性能。
　　将具有优良分离性能的渗透汽化分离技术和膜组件应用于丁醇发酵，根据现有发酵产溶剂能力和渗透汽化分离
体系的分离能力，设计并运行丁醇发酵和分离耦合反应体系是本课题组研究的一大创新点。以PDMS/PVDF为基质的
膜组件在发酵温度39℃下与丁醇发酵进行耦合，在丙酮浓度为0.5 wt%，丁醇浓度为1wt%的发酵液中的分离通量为
92.5 gm-2h-1，透过液的总溶剂浓度为20 wt%左右，发酵中溶剂的移除率为19.1 gm-2h-1左右，显著提高了丁醇
的生产能力。
三、    技术推广及应用前景
    本课题组与中国科学院过程工程研究所联合支持江苏金茂源生物化工有限责任公司申报的“年产6万吨丁醇丙
酮高技术产业化示范工程”正在实施过程中；子课题单位中科院上海生命科学研究院植物生理生态研究所与河南天
冠企业集团有限公司签署了关于丁醇生物法制造的合作协议，转让了菌种，并开展了发酵工艺的合作研究。
　　丁醇作为一种重要的平台化学品和理想的生物燃料受到世界各国的关注和重视。本课题组所获得的新菌株和新
技术取得应用后，有望提升我国生物丁醇产业在国际市场上的竞争力，并为未来进一步开发纤维素丁醇生产菌种和
工艺奠定基础，促进我国生物丁醇产业的发展。