十一 · 五“863工业生物技术”  专题系列报道（8）
腈水合酶/酰胺酶双菌双酶耦联生物催化生产
手性药物中间体(S)-(+)-2,2-二甲基环丙甲酰胺
浙江工业大学  郑裕国
　　腈水合酶和酰胺酶是重要的腈转化酶，可以高效、高选择性地转化腈类化合物制备手性酰胺、羧酸及其衍生物，
在医药、农药及其中间体、食品和饲料添加剂等领域具有广阔的应用前景。亚胺培南/西司他丁钠是新型碳青霉烯类
抗生素的最大品种，是全球畅销的处方药之一，被誉为“抗生素的最后一道防线”，是目前抗重症感染的首选药物。
亚胺培南/西司他丁钠合成难度大，质量要求高，其制造技术被视为衡量一个国家高端抗生素工业水平的重要标志。
由于国内缺乏关键手性中间体(S)-(+)-2,2-二甲基环丙甲酰胺的核心制造技术，亚胺培南/西司他丁钠长期为美国默
克等国外制药巨头垄断。目前(S)-(+)-2,2-二甲基环丙甲酰胺的工业化生产主要采用化学方法，其生产过程反应步
骤多(8步)，收率低(约10%)，尤其是其光学纯度难以达到药物合成的需求。浙江工业大学生物工程研究所与浙江海
正药业股份有限公司在国家“十一五”863计划的资助下，成功开发了腈水合酶/酰胺酶双酶耦联生物催化生产
(S)-(+)-2,2-二甲基环丙甲酰胺新技术，率先在国内实现亚胺培南/西司他丁钠的规模化生产。
一、    项目目标及完成情况
项目目标
完成情况
1. 获得与碳水化合物代谢、丁醇生
物合成、溶剂胁迫应答相关的重要基
因和蛋白的相关信息，分离、克隆
3~4个对丁醇生物合成有重要调控
作用、以及与溶剂胁迫相关的酶及其
编码基因
通过基因组重测和比较基因组学分析，得到突变株相对于野生型共
94个较高准确度的SNP位点，发生SNP突变的编码基因大多与胞壁
合成、非中心碳代谢、膜转运系统以及转录因子有关；通过比较蛋
白质组分析，发现了与溶剂耐受、丁醇生物合成相关的重要分子基
础，克隆了至少20个与丁醇合成或胁迫相关的基因，并研究了其生
理功能。
2. 获得主要生产丁醇和氢气、不产
或低产丙酮或乙醇的丁醇生产菌，分
批发酵中丁醇对葡萄糖转化率达到
40%以上，丁醇发酵时间缩短30%
建立了C.acetobutylicum新型遗传操作系统。根据组学分析的结
果，构建了数株性能优化的基因工程菌。其中丙酮途径缺失的突变
株，丙酮产量大幅下降，将总溶剂中丁醇比例提高到85%~90%，分
批发酵中丁醇对葡萄糖转化率达到40%。
3. 通过基因工程技术和代谢工程技
术，获得能够耐受高浓度丁醇的工程
菌株，分批发酵产量超过40 g/L
建立了适用于丙酮丁醇梭菌的随机突变技术及高通量筛选高产突变
株的方法，获得了能够耐受较高浓度丁醇(≥19 g/L)且溶剂合成能
力大幅度提高的突变株；采用发酵-萃取-气提技术，分批发酵总溶
剂浓度超过40 g/L，并完成了中试。
4. 建立丁醇发酵与分离耦合反应示
范装置，溶剂总浓度≥150 g/L
建立了丁醇发酵-渗透汽化分离耦合反应体系，总溶剂浓度达到184
g/L。
二、    关键技术及主要成果
    1. 腈水合酶与酰胺酶产生菌筛选技术　建立了基于酰基转移活性的高通量立体选择性酰胺酶筛选模型，筛选效
率比传统方法提高500倍以上。获得18株酰胺酶产生菌，其中代尔夫特菌对(R,S)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺的对映
体选择率大于100，是目前国内外发现的对目标底物异构体选择性最严格的菌株。同时，通过分级富集策略筛选获
得了具有自主知识产权的高活力腈水合酶产生菌。
    2. 生物催化剂育种及改造技术　建立了以工业微生物育种技术和分子生物学技术为基础的生物催化剂改良技
术，产腈水合酶菌株经N+注入诱变等处理，腈水合酶活力提高到25万单位以上；代尔夫特菌酰胺酶基因克隆并在
大肠杆菌中实现高效表达，酶活力提高10倍以上。
    3. 底物、产物手性分析检测技术　建立了准确、快捷的气相色谱和液相色谱检测方法。在一根毛细管气相色谱
柱上实现了2,2-二甲基环丙甲酰胺及2,2-二甲基环丙甲酸4个对映体的分离，并建立了通过光学纯度等相对量测定
转化液中4种单体浓度的新方法。
    4. 产物分离纯化与副产物回用技术 　建立了2,2-二甲基环丙甲酰胺及其甲酸的大孔树脂吸附与
(R)-(-)-2,2-二甲基环丙甲酸消旋回用新技术。工业规模条件下(S)-(+)-2,2-二甲基环丙甲酰胺和副产物
(R)-(-)-2,2-二甲基环丙甲酸的收率分别达到86%和89%以上。
    5. (S)-(+)-2,2-二甲基环丙甲酰胺生物催化法生产技术　　建立了腈水合酶/酰胺酶双酶耦联一锅法生物催化
新工艺，实现了产业化。新工艺大大缩短了合成路线 (由8步缩短至2步)，批次转化率达到47%以上(理论值50%)，
批次收率达到40%以上，总收率达到72%以上，e.e.>99%。与化学法相比，废水量减少2/3以上；固体废物减少90%
以上；从源头上革除了氯化亚砜、氯仿、二氯甲烷、乙醚、甲醇、氨水和奎宁等有毒有害溶剂及试剂的使用，生产
成本仅为化学法的1/2左右。
三、市场开发情况及应用前景
　　手性生物催化技术是工业生物技术中发展最为迅猛的领域，目前手性生物催化剂的高效发现、表征和改良是其
规模化应用的基础，生物催化体系、多酶耦联反应、产物回收等工程问题的解决是规模化应用的关键。课题组在手
性生物催化剂腈转化酶的发现、表征、改良等方面取得了突破，建立了高通量立体选择性酰胺酶筛选模型、生物催
化体系产物提取与副产物纯化回用新技术和双酶耦联一锅法生物催化新工艺。项目取得的成果已在联合承担单位浙
江海正药业股份有限公司得到应用并成功实施了产业化，建成了10 t/a药物关键手性中间体(S)-(+)-(2,2)-二甲基
环丙烷甲酰胺的生产线，并与5 t/a高效抗重症感染药物亚胺培南/西司他丁钠原料药生产线相匹配，生产规模国内
最大，亚胺培南/西司他丁钠原料药国内市场占有率90%以上，并大量出口，制剂已进入国内医院临床使用。
    另外，该项目运用立体选择性生物催化，从源头上革除有毒有害原料使用，降低能耗，减少“三废”排放，是
环境友好的新型绿色化学合成新工艺，符合我国建设资源节约、环境友好型社会的需求和趋势。本课题建立的工艺
从工艺源头和过程控制两个层面，彻底革除了氯化亚砜、氯仿及二氯甲烷等有毒有害原辅料的使用，三类溶剂用量
减少50%以上，废水量减少2/3以上，环境效益显著。
　　目前，由耐药性病原菌导致的重症感染已成为困扰我国人民健康的重大医疗难题，而长期的临床应用表明亚胺
培南/西司他丁钠是治疗重症感染的首选药物，疗效确切、市场需求量大，具有广阔的市场空间和发展潜力。