十一 · 五“863工业生物技术” 专题系列报道（9）
新型高比活β－葡聚糖酶的研制
中国农业科学院饲料研究所 杨培龙
β-1,3-1,4-葡聚糖酶是一种重要的工业用酶，广泛应用于饲料工业、啤酒工业和食品工业等。随着应用范围的
拓宽尤其在饲料工业中的推广应用，其市场价值还将大幅度提升。该产品的产业化技术目前被国外垄断，国内虽然
开展了大量的相关研究，但依赖进口的局面始终未能打破。国内生产存在的主要问题有：①国内菌株的产酶水平低，
生产成本高。国外利用基因工程菌株生产，其发酵效价已达到15000IU/mL发酵液，而国内报道的最高水平在
5500IU/mL以下，大部分低于1000IU/mL，难以产业化生产；②国内相关酶的性质不够优良，尤其是酶作用的pH特
性、热稳定性、抗胰蛋白酶和胃蛋白酶能力等综合性质不能满足应用需求。因此，筛选到综合性质优良的新酶、新
基因，并通过生物反应器进行高效表达是β-葡聚糖酶实现产业化生产并在国际市场上形成竞争优势的有效途径。中
国农业科学院饲料研究所在国家“十一五”863计划的资助下，进行了优质葡聚糖酶的高效表达研究。
一、项目目标及完成情况
项目目标：①β-1,3-1,4-葡聚糖酶在重组酵母中小试水平上表达量不低于4mg/mL 发酵液, 效价达到40000
IU/mL 发酵液。②在小试水平上确立稳定、完善的发酵工艺一套；确立表达产物的后处理工艺一套； 加工过程中酶
的丧失不超过20%；酶产品在室温下贮存6 个月酶活性丧失不超过15%。
完成情况：①课题组在基因水平、mRNA二级结构预测及优化、表达载体信号肽和Kozak序列优化以及载体转化
重组位点等途径进行单表达盒的改进，在此基础上，进行多表达盒转化和共转化PDI等手段，逐步提高重组毕赤酵
母的单位表达量。筛选得到的高活性重组菌株，进行5L发酵罐优化研究，结果其蛋白表达量达4.2 mg/ml，葡聚糖
酶活性达42000 IU/ml。②课题组对发酵过程各种关键因素如N/C源、温度、pH、通气量、接种量等进行优化，最
终确立了稳定的发酵方法；同时建立了酶的后加工工艺，在整个酶后加工过程中，酶的回收率在85%以上，且工艺
稳定，重复性好。
二、关键技术及主要成果
1. 新酶
课题组所研制的饲料用酶具有优良的特性，包括热稳定性好且在常温下具有高活性；最适合的pH值在酸性，同
时在整个酸性和中性的pH值范围内又能维持较高活性；对动物胃、胰蛋白酶和其它蛋白酶具有较好的抗性等综合性
质。具有这些优良性质的酶还未曾有过报道。
本研究在原有类芽孢杆菌葡聚糖酶的基础上，针对饲料用酶的特殊性建立了饲料用酶天然产生菌的有效筛选系
统；在山羊瘤胃、铀矿废水和火焰山土壤等环境中筛选获得了具有自主知识产权的综合性质优良的饲料用葡聚糖酶，
包括瘤胃来源的高比活β-葡聚糖酶、金属矿来源的微生物所产嗜酸葡聚糖酶，均具有极优良的综合酶学性质，并且
都能抗胃蛋白酶和胰蛋白酶的水解，具有符合饲料行业应用的pH和温度特性，因此可以广泛应用于饲料、食品加工
及葡萄酒酿制等工业加工过程。
2. 更高的单位表达量
课题组采用了各种方法进行重组酵母菌株的高效表达研究，包括在基因水平、mRNA二级结构预测及优化、表达
载体信号肽和Kozak序列优化以及载体转化重组位点等途径进行单表达盒的改进，在此基础上进行了多表达盒转化
和共转化PDI等手段，逐步提高重组毕赤酵母的单位表达量。在构建的重组菌株中，葡聚糖酶的表达量较研究初期
提高了2.8倍，远远高于国外目前的生产技术。
3. 利用重组酵母生产酶制剂
课题组对筛选得到的高活性重组菌株进行发酵罐优化研究，对发酵过程各种关键因素如N/C源、温度、pH、通
气量、接种量等进行优化，最终确立了稳定的发酵方法。连续批次发酵后，重组菌株表现出良好的表达和遗传稳定
性，经过优化表达后，产物得到了纯化，酶学性质综合测定结果表明，该酶集多项优良性质于一身：①高比活性高
于目前发现的各种来源的β-葡聚糖酶；②能同时水解β-葡聚糖中的β-1,3键和β-1,4键，具有更好的底物适应性
和催化效率；③具有较好的热稳定性；④抗胃蛋白酶和胰蛋白酶的水解。
课题组建立了稳定成熟的毕赤酵母高细胞密度发酵新工艺，在缩短发酵周期的基础上，酶的表达量得到了提高，
并且具有发酵方法简便、原料易得、节能、成本低等特点，适合大、中、小型发酵企业生产。
三、市场开发情况及应用前景
β-1,3-1,4-葡聚糖酶是一种极具经济价值的工业酶制剂，然而其产品和技术却主要控制在丹麦NOVO、荷兰
GIST、美国MILES等几家国际酶制剂公司手中。随着我国饲料加工业的迅猛发展，β-葡聚糖酶的需求量不断增加。
预计到2020年我国饲料产量将达到1.7亿t，β-葡聚糖酶制剂的用量将达1.7万t，年经济效益将达到17亿元，
加上啤酒工业和食品工业等领域的应用, 其市场应用前景十分看好。
在饲料工业中，β-葡聚糖酶的开发应用有助于解决几个问题：①缓解饲料资源短缺。我国养殖业产品的产需处
于刚性增长的态势，饲料粮缺口将逐渐增加，葡聚糖酶的应用可消除饲料粮中的抗营养因子，提高饲料利用率、节
约饲料资源。②减轻环境污染。应用葡聚糖酶制剂可大大减少畜禽排泄物中粘性物质的排出量，从而显著减少土壤
和水体的污染。③提供更为安全的动物产品。酶本身是一种蛋白质，被公认为“绿色”添加剂，葡聚糖酶的应用具
有控制、预防动物疾病、改善动物健康的作用，通过其在饲料中的应用可减少抗生素等对人体有害的饲料添加剂的
使用，对获得优质、安全的动物产品具有重要的意义。
课题组在国内率先将基因工程生产葡聚糖酶的高新技术应用到传统的饲料工业中，开辟了饲料研究中一个极具
发展潜力的新领域。其科技水平处于国际领先地位,具有广阔的市场前景。该研究成果目前已在个别企业用于生产，
产品有望进入国际市场。该成果的推广将为推动基因工程等高新技术向传统饲料工业渗入、开辟饲料工业新领域等
方面起示范作用。