利用木质纤维素CBP生产生物乙醇技术展望
青岛科技大学化工学院 李金伟 张姗姗
    美国能源部能源独立和安全法案要求，到2022年全国的生物燃料产量达到360亿加仑，其中210亿加仑必须来
自可再生可持续的原料（例如木质纤维素）。为达到这个目标，必须研制出能将植物生物质转变成可发酵糖且经济合
算的工艺技术。生产生物乙醇的一种重要途径是利用微生物，通过联合生物加工（CBP）将生物质转化成可发酵糖并
将生成的糖发酵成乙醇。CBP生产生物乙醇不包括纤维素酶的生产和分离过程，而是把糖化和发酵结合到由微生物
介导的一个反应体系中，因此与其他工艺过程相比，底物和原料的消耗相对较低，一体化程度较高。
一、CBP微生物菌株的改造
    虽然CBP工艺可以大幅降低纤维酶的生产成本，但是它对所用的微生物却有较高的要求，微生物必须比传统的
纤维发酵微生物具有更好的底物利用度和较好的产品构型，因此需要对微生物进行改造。CBP微生物菌株的生产改
造途径主要有两种：一种是改造产木质纤维素酶的菌生产乙醇，比如热纤梭菌；另一种是改造产乙醇的菌分解纤维
素，如酿酒酵母和运动发酵单胞菌。
    第一种途径首选厌氧型分解纤维素的细菌，代表微生物是热纤梭菌。该改造途径的目的是提高乙醇产率，消除
副产物，提高对乙醇的耐受性，导入新的代谢基因将糖化产物全部或者大部分进行发酵。最成功的例子是解糖热厌
氧杆菌，它能天然地发酵木聚糖和生物质衍生糖。改造后的解糖热厌氧杆菌的乙醇产率很高，而且不再产生有机酸。
    第二种途径改造后的菌株能够产生乙醇，分泌一系列的外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶，以木质纤维素为惟一碳
源，将来源于纤维素的糖类完全或者大部分进行发酵。这方面的细菌有运动发酵单胞菌、大肠杆菌、产酸克雷伯菌，
酵母有酿酒酵母、嗜鞣管囊酵母、毕赤酵母、休哈塔假丝酵母。
二、真菌CBP——一种新的选择
    1．里氏木霉的性质
    尽管改善纤维素酶方面进步显著而且耗资不多，但是木质纤维素的完全糖化仍需要很长的降解时间和大量的酶
（每克微晶纤维素需要30～50mg酶）。
    作为CBP微生物，里氏木霉生产纤维素降解酶的基本优点有：①相对于其他的微生物，里氏木霉能产生更足量
的酶。②一些特殊的里氏木霉突变体已能低成本生长而且产量满足生物炼制工业的需求。③里氏木霉能利用木质纤
维素糖化产生的所有糖类生产乙醇，具有所有的必须代谢途径，虽然一些新的途径需要调控。
    在里氏木霉成为有效的CBP微生物之前，仍有一些问题需要解决，如对乙醇的耐受性低；因丝状的菌落形态，
发酵时混合搅拌需要更多的能量；乙醇的产量低等。
    里氏木霉在有氧条件下能产生纤维素酶，将纤维素降解成可溶性糖；当变成厌氧条件时，进一步将可溶性糖转
化成乙醇。这表明里氏木霉可作为一种CBP菌株，尽管它的乙醇产量还有待提高。里氏木霉降解纤维素的初级产物
是纤维二糖，而纤维二糖抑制纤维素酶的活性。里氏木霉产生β-D-糖苷酶，该酶能将纤维二糖转化为葡萄糖从而缓
解纤维二糖对酶的抑制。在CBP中，里氏木霉的一个优点是纤维二糖在发酵过程中不会积累，当它由纤维素水解得
到后会很快转化成乙醇。
    2．真菌转化木质纤维素糖成乙醇
    木质纤维素糖包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖五种基本的糖。虽然运动发酵单胞菌和啤酒酵母
能发酵葡萄糖产生乙醇，终浓度分别达到130g/L和160g/L，但它们都不能发酵木糖或阿拉伯糖。据报道，在实验
室条件下一些新的菌株能转化这些糖，如里氏木霉能将五种纤维素糖转化成乙醇。
    虽然一些真菌能产生乙醇，但同时也产生乙酸和乳酸等其他副产物。稻根霉菌能利用多种碳源产生乳酸，尖孢
镰刀菌发酵可产生乙酸，乙酸也是里氏木霉发酵纤维素糖的主要副产物。
    3．真菌转化纤维素成乙醇
　　一些真菌，像念珠菌、镰刀菌、酒曲菌、曲霉、Neocallimastix和木霉能将纤维素转化成乙醇。这些真菌含有
两种生物合成系统，一种是在有氧条件下产生纤维素酶将纤维素降解成可溶性糖；另一种是在厌氧条件下产生乙醇
和其他副产物。据报道，人们从奶牛粪便中分离出一种微生物，该微生物能将纤维素转化成乙醇。通过改良选育，
菌种的乙醇产量提高了12.5倍（从0.4g/L提高到5g/L）。相对于其他丝状真菌，以可溶性糖为底物，里氏木霉的
乙醇产量较低，但以纤维素为底物的乙醇产量较高。这可能是由于里氏木霉能产生大量的纤维素降解酶。
三、真菌CBP发展的里程碑
    里氏木霉将木质纤维素糖转化成乙醇的主要代谢途径包括糖酵解、磷酸戊糖途径和乙醇发酵。里氏木霉能将所
有的生物质糖转化为乙醇，但是乙醇的产量和产率较低，主要原因与基因的低表达和基因编码的酶低活性有关。乙
醇的生成和耐受性的改善可通过以下方法：（1）乙醇耐受基因的鉴定和修饰；（2）引入异源基因，例如酿酒酵母丙
酮酸脱羧酶（PDC）和乙醇脱氢酶，来改善经典乙醇合成途径；（3）去除里氏木霉中某些副产物的相关基因。
    1．乙醇耐受性的改进
    高浓度的乙醇会改变细胞膜上的受体蛋白，产生毒害作用，阻遏糖酵解和新陈代谢，进而抑制细胞的生长和发
酵。大量证据表明，微生物中乙醇耐受基因不是单一基因。因此菌种选育的传统方法难以提高乙醇耐受性。全转录
工程提供了一个新方法，通过SPT15基因中三种转录调控因子基因的分别突变，提高酿酒酵母的乙醇耐受性。这种
方法及其延伸方法能够系统地用来鉴定和修饰里氏木霉转录因子及其他与乙醇耐受性相关的基因。
    2．提高糖转运效率
    为使里氏木霉成功运用于CBP，深入了解糖转运蛋白是必须的。糖类不能自由地穿过细胞膜，微生物是通过特
定的糖转运蛋白来利用糖类，所以了解糖转运机制是必要的。转运蛋白作为培养基中糖浓度的“感受器”，可产生相
应的胞内信号。不同的糖转运蛋白在不同的浓度下行使功能，从而使微生物在较广的范围内利用糖类。尽管里氏木
霉中某些糖转运蛋白已被识别鉴定，但对转运蛋白的更深入研究也是必须的：（1）增强转运蛋白在低糖浓度下对糖
类的亲和力从而提高对糖类的利用；（2）提高转运蛋白数量；（3）表达各种糖类的转运蛋白从而同化利用所有的生
物质糖。
    3．对里氏木霉需氧性的处理
    里氏木霉是一种需氧微生物，在无氧条件下难以长期生存。里氏木霉对氧气依赖的主要原因是用于糖酵解的关
键酶类在缺氧条件下被强烈抑制。在低氧或缺氧条件下，许多基因的表达水平显著改变。据报道，在缺氧条件下，
里氏木霉能将葡糖糖发酵成乙醇且持续13天，当培养条件变成有氧时这些菌丝体能重新生长。
    4．改造里氏木霉丝状体以改良发酵
    里氏木霉是多细胞生长，展开的细胞链形成菌丝。与单细胞酵母相比，里氏木霉菌丝在发酵罐中搅拌混合时需
要更多的能量输入。因此，在应用里氏木霉CBP时，需要将其生长形态改造成紧凑的颗粒球形而不是展开的菌丝体。
四、结论
    累计资料表明，采用CBP能减少将木质纤维素转化成乙醇的成本。尽管CBP发展显著，但是产生的木质纤维素
酶在数量和质量上仍有局限性。这个问题最初通过引入多种纤维素酶外源基因来解决，然而，这些酶的活性和产量
都很低。为了加快CBP的发展，必须考虑选择多种不同的微生物。分解纤维素的真菌（例如里氏木霉）能产生大量
的糖解酶分解纤维素，同化所有纤维素糖，将这些糖转化成乙醇，这表明它具有将木质纤维素转化成生物乙醇的所
有途径。但对于CBP真菌的发展，仍有诸多问题需要解决，如低产量、低乙醇耐受性和低发酵率等。